Kapillærelektroforese er en rekke ulike teknikker som brukes for å analysere spormengder av blant annet aminosyrer og fettsyrer.
I analysen brukes det kapillær-kolonner med en indre diameter på 20 – 180 µm og ytre diameter på 180 – 375 µm. Lengden på kapillær-rørene kan variere mellom 20 cm til flere meter. Hovedfordelen med kapillærelektroforese er at den har en veldig effektiv varmespredning i forhold til vanlig elektroforese. Den effektive varmespredningen fører til at man kan ta i bruk høye spenninger som igjen fører til at separasjonen blir mer effektiv og reduserer separasjonstiden.
I kapillærelektroforese brukes det soneelektroforese og isoelektrisk fokusering i små, tynne kapillær-rør ofte laget av kvarts og dekket med et lag polyamid på utsiden for å styrke kapillær-røret (se figur 1).
Bruksområder
Biomolekyler som peptider, proteiner og nukleinsyrer (DNA og RNA), men også bakterier og virus, er elektrisk ladde i løsninger. De kan separeres ved elektroforese, og det har derfor stor betydning i biokjemi, medisin og molekylærbiologi. Innen disse fagområdene brukes elektroforese både til analyse og til ren fremstilling av enkeltkomponenter i blandinger.
I genteknikk er elektroforese også mye brukt, der den brukes til å bestemme den genetiske informasjonen i DNA.
Elektroforese brukes diagnostisk i medisin, for å påvise forandringer som enkelte sykdommer er årsak til i proteiner, blod og andre kroppsvæsker. Elektroforese av proteiner gir forskjellige mønster for ulike dyre- og plantearter, men også for individer av samme art. Det brukes i landbruksforskningen til identifikasjon og beskrivelse av planter, og i næringsmiddelkontrollen for å bestemme hvilken dyreart kjøttet kommer fra. I biologisk taksonomi brukes elektroforese til å bestemme slektskapet mellom arter.
Prinsipp
Først blir prøven injisert i kapillærene, enten elektrokinetisk eller hydrostatisk. Med hydrostatisk injeksjon vil alikvoten av prøven bli tatt opp i kapillær-røret ved å tilføre et positivt trykk til prøvebegerglasset, mens med elektrokinetisk injeksjon blir det tilført en spenning mellom begerglassene som fører til at alikvoten blir tatt opp. Eventuelt kan hevertmetoden brukes, det vil si at væske kan flyttes fra høyereliggende punkt til et lavereliggende punkt ved hjelp av gravitasjon. Kapillærene er fylt med en buffer. Dermed vil små og store molekyler/partikler blir separert i et elektrisk felt når spenning blir satt på. Teknikken for å separere molekylene fra hverandre er basert på elektroosmotisk flow, noe som er et resultat av forskjellen i den negativt ladde kapillærveggen og de postivt ladde bufferionene som vandrer mot den negative ladede katoden.
Det utvikles en god del varme under analysen og derfor må kapillærene avkjøles. Dette gjøres ved hjelp av lys fra en lyskilde. Lyset fordeler seg i et multikanalsystem med fiberoptikk, som deretter passerer på tvers av kapillæret gjennom et optisk vindu, og dirigeres til en UV - detektor. Her blir signaler lest av ved ulike bølgelengder. Fiberoptikken gjør at en kan fjernplassere lyskilden og detektoren, noe som gjør at varmeutviklingen ikke påvirker kapillærene.
Ulike metoder
Normalt utføres elektroforesen i vann som er gjort ledende med løste elektrolytter. Fordi ladningen på forbindelsene som skal skilles som regel er pH-avhengig (surhetsavhengig), velges elektrolyttsystem som har evnen til å holde jevn surhetsgrad. I de fleste elektroforeseteknikker brukes et porøst medium til løsningen, vanligvis en gel. Gelen brukes ofte som en tynn rektangulær skive, der flere prøver kan settes av ved siden av hverandre slik at de kan sammenlignes. Forbindelsene som skal separeres er som regel usynlige, og må derfor farges eller merkes radioaktivt. På denne måten kan mengder på mindre enn en milliondels gram påvises.
Den vanligste teknikken er soneelektroforese i en gel i et konstant elektrisk felt. Dette brukes blant annet i analyse av nukleinsyrer (DNA). I porøse geler med små porer skilles DNA-fragmenter svært godt etter størrelse. Dette brukes blant annet for å bestemme nukleotidenes rekkefølge (den genetiske informasjonen) i DNA.
Figur 1: Oppsett av kapillærelektroforesekammer.
Isoelektrisk fokusering
Isoelektrisk fokusering er en metode som utnytter molekylenes isoelektriske punkt. Det er der pH-verdien til molekylet er elektrisk nøytralt, og ikke beveger seg i det elektriske feltet. Molekylene vandrer i en bane med varierende pH til det stedet hvor pH-en tilsvarer deres isoelektriske punkt og der stopper de. Denne metoden har høy oppløsning, og kan brukes til å skille proteiner som bare skiller seg fra hverandre på ladningen av én aminosyre.
SDS - elektroforese
SDS-elektroforese brukes til å bestemme molekylvekten til proteiner. Her utføres elektroforesen i gelmediet med negativt ladde såpemolekyler (SDS). Molekylene bindes til proteinene, og gir dem en enhetlig ladning slik at det bare er størrelsen som bestemmer vandringshastigheten. Denne metoden kan også brukes til å skille proteiner som ikke er løselige i vann.
Todimensjonal gelelektroforese
Todimensjonal gelelektroforese er en teknikk der to prosesser kombineres. Isoelektrisk fokusering kan for eksempel brukes i den ene retningen, og soneelektroforese vinkelrett på den første retningen. Denne metoden brukes blant annet i cellebiologi for å kartlegge blandinger av proteiner og peptider i celler.
Figur 2: Prinsippene til sone-elektroforese (vanlig elektroforese) , isotachoforese og isoelektrisk fokusering.
Referanser
- Burtis, C.A, Ashwood, E.R., Bruns, E.D., Tietz Fundamentals of Clinical Chemistry (6th ed.), Saunders, Missouri 2008, Chapter 6
- http://www.nito.no/Fagmiljoer/Bioingeniorfaglig-institutt/Bioingenioren/Alle-Bioingeniorene/Bioingenioren-2006/Bioingenioren-806/Kapillarelektroforese-brukt-som-rutineanalyse-av-serumproteiner/ (Er ikke lengere tilgjengelig fra 11.11.2015)
- http://snl.no/elektroforese