Isoelektrisk fokusering er en seperasjonsteknikk hvor proteiner separeres ved elektroforese på grunnlag av forskjeller i proteinenes isoelektriske punkt, pI. Det isoelektriske punktet til et molekyl er den pH-verdien hvor molekylet er elektrisk nøytralt, altså har ladning lik 0. Det isoelektriske punktet avhenger av proteinets bestemte aminosyresekvens.
I isoelektrisk fokusering benyttes oftest en polyakrylamid gel som inneholder en stabil pH gradient. pH gradienten etableres ved hjelp av en blanding bæreramfolytter, som er en gruppe amfotære polyaminokarboksylsyrer med varierende pKa verdier og Mw mellom 300-1000 g/mol (Da). Bæreramfolyttene tisettes gelen og når det elektriske feltet skrues på, vil bæreramfolyttene vandre mot sine respektive pI verdier og slik etablere en pH gradient. Når påsatte proteiner vandrer over gelen vil de stoppe opp ved den pH som tilsvarer proteinets pI, da elektriske nøytrale molekyler ikke vil bevege seg i et elektrisk felt (figur 1).
Separerte proteinbånd kan visualiseres ved tilsetning av fargestoffet Coomassie blue, som vil binde seg til proteinene og farge båndene blå. Jo sterkere blåfarge, jo høyere konsentrasjon av protein er tilstede i båndet. Seperasjon ved isoeletrisk fokusering gir oppløsning opp til 0,02 pH enheter mellom pI verdier og kan derfor brukes til å skille proteiner som er veldig like hverandre. Forskjellen kan ligge i ladningen av én aminosyre.
Figur 1: Til venstre: Påsatt proteinfraksjon vandrer over gelen inntil proteinene har nådd sine isoelektriske punkt. Etterfølgt av SDS page hvor proteiner med identisk pI, separeres på grunnlag av størrelse.
Til høyre: ved isoelektrisk fokusering separeres proteinene på grunnlag av forskjeller i pI, uavhengig av størrelse.
Et viktig poeng som illustreres i figur 1.2, er at proteinene, uavhengig av størrelse, separeres etter pI.
Isoeletrisk fokusering kan etterfølges av SDS Page som innebærer at gelen som er kjørt ved isoelektrisk fokusering behandles med SDS ( sodium dodecyl sulfate) og β-mercaptoethanol (HS-CH2CH2OH). Behandlingen denaturerer proteinene i gelen og etablerer et forhold mellom ladning og masse som er likt for alle proteinene. Proteinene kjøres ved elektroforese over ny gel, og separeres på grunnlag av størrelse. Slik vil ulike proteiner med identisk/lik pI, kunne separeres fra hverandre (se figur 1).
Klinisk bruk
Isoelektrisk fokusering er mye brukt ved sykehus for påvisning av proteiner som f.eks IgG i spinalvæske. Ved denne analysen benyttes en agarose gel da IgG proteinene er for store til å kunne separeres over en polyakrylamid gel.
Referanser
- Clark D.P og Pazdernik N.J. Molecular Biology. 2.utg. USA: Elsevier Inc; 2013. s.462-463
- Burtis C.A. m.fl. Tietz Fundamentals of Clinical Chemistry. 6.utg. USA: Saunders Elsevier;2008. s. 107
- Jacobsen E. Elektroforese. Sitert den 04.11.2013. Tilgjengelig fra: http://snl.no/elektroforese
- Akershus Universitetssykehus. Isoelektrisk fokusering av IgG i spinalvæske. Sitert den 05.11.2013.
Tilgjengelig fra: http://old.ahus.no/eqs/labhbok/docs/doc_15290/index.html - Proteiners struktur og funktion. Sitert den 05.11.2013.
Tilgjengelig fra: http://subsites.egaa-gym.dk/nr/biologi/roholt/Hjemmeside/Undervisning%20online/proteiner/proteiner.html - Life technologies. Isoelectric focusing. Sitert den 05.11.2013.
Tilgjengelig fra: http://www.lifetechnologies.com/no/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/protein-gel-electrophoresis/protein-gels/specialized-protein-separation/isoelectric-focusing