Enzymaktivitetsmåling er en måling på reaksjonshastigheten mellom enzym og substrat. Enzymet og substratet reagerer med hverandre som vist i ligning 1.
Enzym + Substrat -> Enzymsubstratkompleks -> Produkt + Enzym
Reaksjonen er også vist i figur 1.
Figur 1
Nedbrytningen av enzymsubstratkompleks (ES-kompleks) til fritt enzym og produkt går betydelig saktere enn enzymsubstratreaksjonen. ES-kompleksene kan, ved konstante forhold, brukes til å beregne reaksjonshastigheten som også er proporsjonal med enzymkonsentrasjonen.
Det er nødvendig å undersøke forholdet mellom reaksjonshastighet og substratkonsentrasjon. Dette må gjøres over et stort område av substratkonsentrasjoner. Reaksjonshastigheten varierer og er avhengig av substratkonsentrasjonen. Der substratkonsentrasjonene er lave, er reaksjonshastigheten lav, det kalles 1. ordens kinetikk. Ved høye substratkonsentrasjoner er reaksjonshastigheten høy, 0. ordens kinetikk.
Absorbansen til løsningene med ulik substratkonsentrasjon måles ved bruk av spektrofotometer. Her måles to absorbanser på to prøver med samme innhold:
1) Absorbansen til en prøve hvor enzymene har reagert med substratet.
2) Absorbansen til en prøve hvor enzymene ikke har reagert med substratet.
Reaksjonshastigheten kan så beregnes ut i fra konsentrasjonene/absorbansene til de to prøvene. Dette kan gjøres på instrumentet eller manuelt.
Dersom en regner ut reaksjonshastigheten manuelt kan man benytte Michaelis-Mentenligningen (ligning 2) for å finne den maksimale reaksjonshastigheten for enzymet (Vmax). Vmax er den ene parameteren som er karakteristisk for hvert enkelt enzym. Den andre parameteren er Km (Michaelis-konstanten), som er substratkonsentrasjonen ved den maksimale reaksjonshastigheten.(2) Dette illustreres i figur 2.
Figur 2. Michaelis-Mentenkurve
Likning 2: V = (Vmax + [S]) / (Km + [S])
Lineweaver-Burk funkjonen er en lineær utgave av Michaelis – Menten kurven. Man vil da få 1/[S] på x-aksen og 1/km som skjærer y-aksen ved 1/Vmax og x-aksen ved -1/km. Deretter kan man bestemme de kinetiske konstantene Vmax og km for enzymreaksjonen.
Dette illustreres i figur 3.
Figur 3. Lineweaver-Burkkurve
Kilder:
Figur 1: http://da.wikipedia.org/wiki/Fil:Induced_fit_diagram_da.svg
2)http://www.bio.uio.no/plfys/haa/leks/e/enzymki.htmTietz, ”Fundamentals og clinical chemistry”, Saunders, 2008 (s.144-146)