Created by Unknown User (pmedblad), last modified on 18.09.2018
Cobas TaqMan 48 er et PCR instrument som brukes til in vitro amplifisering (forsterking) av DNA. Ved bruk av PCR kan et stort antall kopier av en bestemt DNA- sekvens lages (f.eks et kromosom). PCR kan f.eks kvantitere HIV, Hepatitt og klamydia fra plasma, serum og urin. Taq- PCR er avhengig av Mg2+- ioner (fra MgCl2).
Til PCR trengs følgende reaksjonsblanding:
Templat DNA
To primere
DNA polymerase
Byggesteinene. A,T,G,C (1)
1: Før PCR starter, ekstraheres RNA fra DNA i et prepareringsinstrument (eksempel Cobas Ampliprep). En celle fra en person, eller en viruspartikkel kan være utgangspunktet. Et cellelysat kan også være tilstrekkelig. Med revers transkriptase blir RNA transkriptert til cDNA
2: Man har reaksjonsblandingen (pkt 1) i et lite plastrør. Røret plasseres i PCR- instrumentet (termosykler). DNA- templaten vil bli denaturert ved 95 ° C.
3: Ved å avkjøle plastrøret ca. 50° C vil primer DNA som er enkelttrådet binde seg til templat-DNA ved hjelp av hybridisering (primer annealing).
4: Primer 1 og 2, som er bundet til hver sin templattråd, er utgangspunktet for DNA- syntesen. Primerene hybridiseres til flankerende DNA på hver sin side av DNA- sekvensen, slik at deres fri 3'- OH- ender peker mot mål- DNA (ca.70° C), med dNTP som byggesteiner (A,T,G,C).
5: Når rekasjonen er fullført, kan resultatet kontrolleres ved at man kjører en gel elektroforese med størrelsesmarkører. Man skal da ha ett DNA- produkt som synes som ett klart bånd. (1)
Analyse kvantifisering:
Deteksjonen skjer ved hver syklus for Real- time PCR
Prøvene i hver av brønnene blir kontrollert med egnet eksitasjons og emisjons- fiberoptisk lys.
Antall kopier av ett virus på DNA-et avgjør hvordan deteksjonskurven ser ut (2)
Fluorescensdata blir avlest ved hver syklus med kinetisk metode. Kvantifisering av kopier på DNA-et viser hvor stor mengde virus som er detektert i cellene. Ved hepatitt- kvantitering fremkommer resultatene som IU/ml fra instrumentet. Etter ønske fra rekvirent, blir denne enheten omregnet til kopier/ml. Ved HIV- kvantiteting, omregner instrumentet selv resultatet til kopier/ml. Svar på analyse av klamydia gis ut som positiv og negativ.
Kildehenvisning: 1. Sjøberg, N. O (2006). Molekylær genetikk: Vett & Viten. Side 176- 181 2. Opplæring: COBAS AmpliPrep/TaqMan 48 med Amplilink 3.1 programvare IVD Generic Capture & TNAI, Treningsmanual (versjon 2.0, mars 2006).
PCR kan f.eks kvantitere HIV, Hepatitt og klamydia fra plasma, serum og urin. Taq- PCR er avhengig av Mg2+- ioner (fra MgCl2).
Til PCR trengs følgende reaksjonsblanding:
1: Før PCR starter, ekstraheres RNA fra DNA i et prepareringsinstrument (eksempel Cobas Ampliprep). En celle fra en person, eller en viruspartikkel kan være utgangspunktet. Et cellelysat kan også være tilstrekkelig. Med revers transkriptase blir RNA transkriptert til cDNA
2: Man har reaksjonsblandingen (pkt 1) i et lite plastrør. Røret plasseres i PCR- instrumentet (termosykler). DNA- templaten vil bli denaturert ved 95 ° C.
3: Ved å avkjøle plastrøret ca. 50° C vil primer DNA som er enkelttrådet binde seg til templat-DNA ved hjelp av hybridisering (primer annealing).
4: Primer 1 og 2, som er bundet til hver sin templattråd, er utgangspunktet for DNA- syntesen. Primerene hybridiseres til flankerende DNA på hver sin side av DNA- sekvensen, slik at deres fri 3'- OH- ender peker mot mål- DNA (ca.70° C), med dNTP som byggesteiner (A,T,G,C).
5: Når rekasjonen er fullført, kan resultatet kontrolleres ved at man kjører en gel elektroforese med størrelsesmarkører. Man skal da ha ett DNA- produkt som synes som ett klart bånd. (1)
Analyse kvantifisering:
Fluorescensdata blir avlest ved hver syklus med kinetisk metode.
Kvantifisering av kopier på DNA-et viser hvor stor mengde virus som er detektert i cellene. Ved hepatitt- kvantitering fremkommer resultatene som IU/ml fra instrumentet. Etter ønske fra rekvirent, blir denne enheten omregnet til kopier/ml.
Ved HIV- kvantiteting, omregner instrumentet selv resultatet til kopier/ml. Svar på analyse av klamydia gis ut som positiv og negativ.
Kildehenvisning:
1. Sjøberg, N. O (2006). Molekylær genetikk: Vett & Viten. Side 176- 181
2. Opplæring: COBAS AmpliPrep/TaqMan 48 med Amplilink 3.1 programvare
IVD Generic Capture & TNAI, Treningsmanual (versjon 2.0, mars 2006).