Cobas TaqMan 48 er et PCR instrument som brukes til in vitro amplifisering (forsterking) av DNA. Ved bruk av PCR kan et stort antall kopier av en bestemt DNA- sekvens lages (f.eks et kromosom). PCR kan f.eks kvantitere HIV, Hepatitt og klamydia fra plasma, serum og urin. Taq- PCR er avhengig av Mg2+- ioner (fra MgCl2).
Til PCR trengs følgende reaksjonsblanding:
Templat DNA
To primere
DNA polymerase
Byggesteinene. A,T,G,C (1)
1: Før PCR starter, ekstraheres RNA fra DNA i et prepareringsinstrument (eksempel Cobas Ampliprep). En celle fra en person, eller en viruspartikkel kan være utgangspunktet. Et cellelysat kan også være tilstrekkelig. Med revers transkriptase blir RNA transkriptert til cDNA
2: Man har reaksjonsblandingen (pkt 1) i et lite plastrør. Røret plasseres i PCR- instrumentet (termosykler). DNA- templaten vil bli denaturert ved 95 ° C.
3: Ved å avkjøle plastrøret ca. 50° C vil primer DNA som er enkelttrådet binde seg til templat-DNA ved hjelp av hybridisering (primer annealing).
4: Primer 1 og 2, som er bundet til hver sin templattråd, er utgangspunktet for DNA- syntesen. Primerene hybridiseres til flankerende DNA på hver sin side av DNA- sekvensen, slik at deres fri 3'- OH- ender peker mot mål- DNA (ca.70° C), med dNTP som byggesteiner (A,T,G,C).
5: Når rekasjonen er fullført, kan resultatet kontrolleres ved at man kjører en gel elektroforese med størrelsesmarkører. Man skal da ha ett DNA- produkt som synes som ett klart bånd. (1)
Analyse kvantifisering:
Deteksjonen skjer ved hver syklus for Real- time PCR
Prøvene i hver av brønnene blir kontrollert med egnet eksitasjons og emisjons- fiberoptisk lys.
Antall kopier av ett virus på DNA-et avgjør hvordan deteksjonskurven ser ut (2)
Fluorescensdata blir avlest ved hver syklus med kinetisk metode. Kvantifisering av kopier på DNA-et viser hvor stor mengde virus som er detektert i cellene. Ved hepatitt- kvantitering fremkommer resultatene som IU/ml fra instrumentet. Etter ønske fra rekvirent, blir denne enheten omregnet til kopier/ml. Ved HIV- kvantiteting, omregner instrumentet selv resultatet til kopier/ml. Svar på analyse av klamydia gis ut som positiv og negativ.
Kildehenvisning: 1. Sjøberg, N. O (2006). Molekylær genetikk: Vett & Viten. Side 176- 181 2. Opplæring: COBAS AmpliPrep/TaqMan 48 med Amplilink 3.1 programvare IVD Generic Capture & TNAI, Treningsmanual (versjon 2.0, mars 2006).
PCR kan f.eks kvantitere HIV, Hepatitt og klamydia fra plasma, serum og urin. Taq- PCR er avhengig av Mg2+- ioner (fra MgCl2).
Til PCR trengs følgende reaksjonsblanding:
1: Før PCR starter, ekstraheres RNA fra DNA i et prepareringsinstrument (eksempel Cobas Ampliprep). En celle fra en person, eller en viruspartikkel kan være utgangspunktet. Et cellelysat kan også være tilstrekkelig. Med revers transkriptase blir RNA transkriptert til cDNA
2: Man har reaksjonsblandingen (pkt 1) i et lite plastrør. Røret plasseres i PCR- instrumentet (termosykler). DNA- templaten vil bli denaturert ved 95 ° C.
3: Ved å avkjøle plastrøret ca. 50° C vil primer DNA som er enkelttrådet binde seg til templat-DNA ved hjelp av hybridisering (primer annealing).
4: Primer 1 og 2, som er bundet til hver sin templattråd, er utgangspunktet for DNA- syntesen. Primerene hybridiseres til flankerende DNA på hver sin side av DNA- sekvensen, slik at deres fri 3'- OH- ender peker mot mål- DNA (ca.70° C), med dNTP som byggesteiner (A,T,G,C).
5: Når rekasjonen er fullført, kan resultatet kontrolleres ved at man kjører en gel elektroforese med størrelsesmarkører. Man skal da ha ett DNA- produkt som synes som ett klart bånd. (1)
Analyse kvantifisering:
Fluorescensdata blir avlest ved hver syklus med kinetisk metode.
Kvantifisering av kopier på DNA-et viser hvor stor mengde virus som er detektert i cellene. Ved hepatitt- kvantitering fremkommer resultatene som IU/ml fra instrumentet. Etter ønske fra rekvirent, blir denne enheten omregnet til kopier/ml.
Ved HIV- kvantiteting, omregner instrumentet selv resultatet til kopier/ml. Svar på analyse av klamydia gis ut som positiv og negativ.
Kildehenvisning:
1. Sjøberg, N. O (2006). Molekylær genetikk: Vett & Viten. Side 176- 181
2. Opplæring: COBAS AmpliPrep/TaqMan 48 med Amplilink 3.1 programvare
IVD Generic Capture & TNAI, Treningsmanual (versjon 2.0, mars 2006).