...
I isoelektrisk fokusering benyttes oftest en polyakrylamid gel som inneholder en stabil pH gradient. pH gradienten etableres ved hjelp av en blanding bæreramfolytter, som er en gruppe amfotære polyaminokarboksylsyrer med varierende pKa verdier og Mw mellom 300-1000 g/mol (Da). Bæreramfolyttene tisettes gelen og når det elektriske feltet skrues på, vil bæreramfolyttene vandre mot sine respektive pI verdier og slik etablere en pH gradient. Når påsatte proteiner vandrer over gelen vil de stoppe opp ved den pH som tilsvarer proteinets pI, da elektriske nøytrale molekyler ikke vil bevege seg i et elektrisk felt (figur 1).
Separerte proteinbånd kan visualiseres ved tilsetning av fargestoffet Coomassie blue, som vil binde seg til proteinene og farge båndene blå. Jo sterkere blåfarge, jo høyere konsentrasjon av protein er tilstede i båndet. Seperasjon ved isoeletrisk fokusering gir oppløsning opp til 0,02 pH enheter mellom pI verdier og kan derfor brukes til å skille proteiner som er veldig like hverandre. Forskjellen kan ligge i ladningen av én aminosyre.
Figur 1: Til venstre: Påsatt proteinfraksjon vandrer over gelen inntil proteinene har nådd sine isoelektriske punkt. Etterfølgt av SDS page hvor proteiner med identisk pI, separeres på grunnlag av størrelse.
...