Kolesterol målt med CHOD/PAP-metoden er en manuell metode for å måle konsentrasjonen av total kolesterol i serum og plasma.
CHOD/PAP-metoden er en kolorimetrisk metode, noe som vil si at man måler konsentrasjonen ved hjelp av et farget kompleks. Dette utføres ved hjelp av et spektrofotometer med sipper. Det settes opp en kalibreringsrekke med flere kalibratorer, inkludert reagensblank. Det settes også opp en kontroll og en eller flere prøver, som alle består av to paralleller. Ved avlesning av absorbans brukes innstillingen “Quantitative mode”, og konsentrasjonene til kontrollen og prøven(e) regnes så ut av instrumentet ved hjelp av en kalibreringskurve. Ved riktig kalibrering er dette en presis metode.
Kolesterol befinner seg både som kolesterolester og fritt som kolesterol i blodet. Reaksjonene skjer gjennom tre trinn, da ved blanding av reagens og serum/plasma slik:
• Da mye av kolesterolet befinner seg i bundet kolesterolester form går første trinn ut på å skille kolesterolesteren ved hjelp av enzymet kolesterolesterase (CHE) (2):
• Deretter omdannes kolesterol til kolesteron og hydrogenperoksid ved hjelp av enzymet kolesteroloksidase (CHOD) (2):
• Til slutt omdannes hydrogenperoksid, 4-aminophenazone (PAP) og phenol til 4-(p-benzoquinone-monoimino)-phenazone ved hjelp av enzymet peroksidase (POD) (2):
Reagenset som brukes inneholder tre enzymer som sørger for at tre ulike delreaksjonene kan skje. Sluttproduktet er her ett rødt fargekompleks (4-(p-benzoquinone-monoimino)-phenazone), som avleses spektrofotometrisk ved 500 nm. Ved å finne absorbansen til fargekomplekset kan man finne dens konsentrasjon, og dermed også konsentrasjonen til kolesterol. Det er en klar sammenheng mellom 4-(p-benzoquinone-monoimino)-phenazone og innhold av kolesterol i prøven. Forholdet mellom absorbans og konsentrasjon er vanligvis lineært opp til 15,54-18,13 mmol/L.
Under kan du se en liten instruksjonsvideo om hvordan man lager oppsett og pipetterer prøver i manuell metode:
| Widget Connector | ||
|---|---|---|
|
...
Referanser
1) Burtis, Ashwood, Bruns: Tietz, Fundamentals of Clinical Chrmistry, sixth edition (s. 422)
2) Laboratoriekurshefte L1 og L2, Medisinsk Laboratorieteknologi 2: Kvantitative teknikker, 2. bio, høst - 2011, oppgave 2a (sist sjekket 22.09.12)