Spektrofotometri er en metode som utføres på et spektrofotometer. Det er måling av lysmengden som går gjennom spektrofotometeret og blir tatt opp i en løsning ved en bestemt bølgelengde i instrumentet. Et spektrofotometer består av en lyskilde (lamper), prisme, spalte, strølysfilter, fotodetektor, monokromator og kuvette.
Design
Det brukes to lamper som lyskilde i spektrofotometri, dette for å kunne dekke hele bølgelengdeområdet med både synlig lys og UV-lys. En Wolfram eller halogenlampe sender ut synlig lys, mens en deuteriumlampe sender ut UV-lys. Lampene sender ut hele lysspekteret på et prisme, hvor lyset blir brutt i alle spekterets farger. Da de ulike spektrene har ulike bølgelengder, vil de bli brutt ulikt inne i prismet. Denne brytningen gjør at det går et snevert bølgelengdeområde gjennom spalten. Fra spalten sendes bølgelengdeområdet videre til strølysfilteret. Her blir de uønskede bølgelengdene filtrert bort og de igjenværende bølgelengdene sendt videre til en monokromator. Monokromatorensiler ut én bølgelengde, det vil si at når lyset har passert monokromatoren er det kun en bølgelengde som sendes ut på kuvetten som inneholder prøveløsningen.
Noen spektrofotometer har en sipper som tar inn en prøveløsning og overfører den til en flow-kuvette til absorbans- eller transmisjonsavlesning. Det vil være viktig å velge korrekt kuvette til analysen. Kuvetter av glass må ikke brukes i analyser hvor man er i UV-området da glass ikke slipper gjennom UV-lys. (2)
Forskjellige typer spektrofotometer
Det finnes to hovedtyper spektrofotometer; enkeltstråle- og dobbeltstrålespektrofotometer. Hovedforskjellen på disse er at enkeltstrålespektrofotometer kun har en monokromator og en kuvette, mens dobbeltstrålespektrofotometeret har to. Dette fordi det er en prøvelysvei i et enkeltstrålespektrofotometer, mens det er to lysveier, en prøvelysvei og en referanselysvei, i et dobbeltstrålespektrofotometer.
Selv om dobbeltstrålespektrofotometer har en komperativt enklere og mer stabil målingprosess, kan enkeltstrålespektrofotometer ha et større dynamisk område, og er også optiskt enklere og mer kompakte. Spektrofotometer bygget på spesialiserte instrumenter, for eksempel mikroskop, er oftest enkeltstrålespektrofotometer av slike praktiske årsaker. Vedlikehold av dobbelstrålespektrofotometer er vanligvis vesentlig dyrere enn for enkeltstrålespektrofotometer på grunn av den følsomme optikken.
Funksjon og bruk
I prøven blir elektromagnetisk energi tatt opp eller avgitt av atomer. Når energi blir tatt opp av atomene i løsningen kalles det absorpsjon, mens fraksjonen av den inkommende energien som blir transmittert gjennom løsningen kalles transmisjon.
Prøven vil absorbere noe av lyset, mens noe blir transmittert. Det transmitterte lyset går videre til en fotodetektor, hvor lysenergien blir omdannet til elektrisk energi. Den elektriske energien går så videre til en forsterker før den blir sendt til en avleseenhet hvor absorbansen blir avlest ved hjelp av et viserinstrument eller et digitalt display.
Det absorberte lyset vil være komplementærfargen av det lyset som blir transmittert og som man vil se. En rød løsning (650 nm) vil absorbere en blågrønn farge (500 nm).
Ut fra absorbansmålingene er det mulig å finne konsentrasjon av prøve i løsningen, da målt absorbans er proporsjonal med konsentrasjonen i prøven (Beers lov). Det benyttes kalibrator med kjent konsentrasjon til å beregne en lineær graf, og flere paralleller av en kontroll og prøve blir deretter kjørt gjennom spektrofotometeret. Deretter beregnes prosentavvik mellom parallellene, som bestemmer om kontroll og prøve kan brukes videre ut fra oppgitt CV (ofte 3-5%). Kontrollen sjekkes deretter mot fasitverdi, og er den innenfor akseptabelt område ± 2 standardavvik godkjennes kontrollen og konsentrasjonen av prøven kan leses av graf eller beregnes.
Forholdet mellom transmisjon og absorbans i spektrofotometri
Når en innfallende lysstråle med intensitet l0 passerer gjennom en firkantet celle (kyvette) som inneholder en forbindelse som absorberer lys av en bestemt bølgelengde, lambda λ (fig. 2), gitt at intensiteten av det utsendte lysstrålen er I, transmitteres lyset som:
T=I\I0
En del av det innfallende lyset kan derimot bli reflektert for eksempel av overflaten av kyvetten eller det kan bli absorbert av kyvetteveggen eller oppløsningsmiddelet. Disse faktorene er eliminert ved bruk av en referansecelle identisk med prøvecellen.
Transmisjon (T) som går gjennom denne referansecellen er IR dividert med I0, transmittansen for forbindelsen i løsning er da definert som I dividert med IR. I praksis blir referansecellen satt inn instrumentet og instrumentet blir justert til en vilkårlig avlesningsskala på 100 (tilsvarende 100% T). Mengden av det absorberte lyset (A) som det innfallende lyset passerer gjennom er ekvivalent med
A=-log^I\IR=-log T (3)
Spektrofotometri anvendes på kjemiske analyser, hvor det oftest er kvalitative analyser. Eksempler på slike analyser er analyse av serum, fullbod eller plasma.
Figur 1: Eksempel på en skjematisk oppbygning av et dobbeltstrålespektrofotometer.
Figur 2. Transmittans av lys gjennom prøven og referansecelle.
Kilder:
1. Burtis, Ashwood & Bruns Fundamentals of Clinical Chemistry (2008), 6th edition, St. Louis Missouri
2. TKJE1002A-14H Generell Kjemi Spektrofotometri teorihefte (Lene Østby)
3. Burtis, C.A & Bruns, D.E Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics (2008), 7th edition St.Louis Missouri (131 – 132)
Figur 2: http://legeforeningen.no/PageFiles/107473/Klingenberg%20Spektrofotometri.pdf (22.9.2015)