Kinsearch - Automatisert fotometri: på Pentra 400
Ved bruk av analysemetoden Kinsearch på Pentra 400 måles absorbansverdier med jevne mellomrom. Verdiene blir plottet i et koordinatsystem, og for så å finne hvordan absorbansverdiene endrer seg, må man ta i bruk en statistikkteknikk kalt regresjon. Regresjonsplott hjelper oss å finne en matematisk funksjon på bakgrunn av reaksjonshastighet og enzymaktivitetmålingene.
Det finner 2 ulike måter å gjennomføre regresjonen på:
Kinsearch beregningsprinsipp
Et lineært søk på instrumentet for å bestemme reaksjonshastigheten; ∆A / min, når endringer i absorbans mellom første og siste absorbansavlesning er på over 0,002 absorbansenheter.
Kinetisk beregningsprinsipp
En lineær regresjon på instrumentet for å bestemme reaksjonshastigheten; ∆A / min, når endringer i absorbans mellom første og siste absorbansavlesning er på under 0,002 absorbansenheter.
Kinsearch beregningsprinsipp
For å fastsette enzymaktiviteten utføres et lineært søk på hver kuvette for å finne det lineære spekteret. Lineær regresjon utføres heretter på alle målingspunkter innen dette lineære spekteret. Reaksjonslinjens helning er lik reaksjonshastigheten (∆A / min).
Det finnes to lineære søkeprogrammer: spesielt og normalt.
Det spesielle programmet benyttes dersom kurven overholder følgende betingelser:
- Det er en fallende kurve: A0 > A1
- Det er en ikke-lineær begynnelse på kurven: 0.9 . ∆a > ∆b
Det normale programmet benyttes for alle andre kurver.
Forkortelser benyttet i teksten:
- A0 = absorbansverdi på tidspunkt for første avlesning
- An = absorbansverdi på tidspunkt for siste avlesning
A - Spesielt program
Enden på det lineære spekteret:
De fortløpende avleste absorbansmålingene sammenlignes helt til den påfølgende absorbansendringen blir større eller lik den forrige.
Det målepunktet som benyttes for begge intervaller fastsettes som punkt I.
Et hjelpepunkt (APE) settes 12 sekunder før punkt I i tid, men ved samme absorbans.
For å finne ut hvor det lineære spekteret ender, trekker man rette linjer fra APE-punktet til hvert absorbanspunkt i en sekvens som starter med An. Tangentene av de vinklene som dannes av hver av disse linjene sammenlignes sekvensielt.
Tangent av vinkel = ∆Absorbans / ∆Tid
Når tangenten av den vinkelen som sammenlignes er mindre eller lik den forrige tangenten, defineres det punktet som ble brukt til å tegne den tilknyttede linjen som enden (E) på det lineære spekteret.
Figur 1: Spesielt tilfelle, enden på det lineære spekteret
Begynnelsen på det lineære spekteret:
Et hjelpepunkt (APB) avsettes 12 sekunder før punkt E i tid, men ved samme absorbans.
Rette linjer trekkes fra APB-punktet til hvert absorbanspunkt i en sekvens som starter med A0. Også her vil tangentene av de vinklene som dannes av hver av disse linjene sammenlignes sekvensielt.
Når tangenten av den vinkelen som sammenlignes er større eller lik den forrige tangenten, defineres det punktet som ble brukt til å tegne den tilknyttede linjen som begynnelsen (B) på det lineære spekteret.
Figur 2: Spesielt tilfelle, begynnelsen på det lineære spekteret
B - Normalt program
Enden på det lineære spekteret:
Et hjelpepunkt (APE) avsettes 12 sekunder før punkt A0, men ved samme absorbans.
Rette linjer trekkes fra APE-punktet til hvert absorbanspunkt i en sekvens som starter med An. Tangentene av de vinklene som dannes av hver av disse linjene sammenlignes sekvensielt.
Når tangenten av den vinkelen som sammenlignes er mindre eller lik den forrige tangenten, defineres punktet som ble brukt til å tegne den den tilknyttede linjen som enden (E) på det lineære spekteret.
Figur 3: Normalt tilfelle, enden på det lineære spekteret
Begynnelsen på det lineære spekteret:
Et hjelpepunkt (APB) avsettes 12 sekunder etter punkt An i tid, men ved samme absorbans.
Rette linjer trekkes fra APB-punktet til hvert absorbanspunkt i en sekvens som starter med A0. Også her vil tangentene av de vinklene som dannes av hver av disse linjene sammenlignes sekvensielt.
Når tangenten av den vinkelen som sammenlignes er mindre eller lik den forrige tangenten, defineres punktet som ble brukt til å tegne den tilknyttede linjen som begynnelsen (B) på det lineære spekteret.
Figur 4: Normalt tilfelle, begynnelsen på det lineære spekteret
Referanser
- http://en.wikipedia.org/wiki/Regression_analysis
- Brukermanualen til Pentra 400