Kinetisk metode

Ved kinetiske analysemetoder gjøres målinger under dynamiske forhold der konsentrasjonen av reaktanter og produkt endres som en funksjon av tiden.

 Mange kinetiske metoder baseres på katalyse-reaksjoner. I Katalyse-reaksjoner øker eller senker enkelte stoffer hastigheten til kjemiske reaksjoner, uten å selv inngår verken som utgangstoff eller produkt av reaksjonen.

Kinetiske metoder er i hyppig bruk ved kliniske laboratorier og laboratorier der det ellers utføres biokjemiske analyser.

For å få en verdi på reaksjonshastighet ved analyser på laboratoriet, benyttes regresjon mellom punktene i måleseriene. En ender da opp med en matematisk funksjon, som ved flere forsøk vises å være delvis lineær. 

Kinetisk metode er en form for lineær regresjonsanalyse som utføres på alle målepunkter, inkludert mellom første og siste avlesning, i for eksempel absorbans. Stigningstallet til tangenten på den lineære delen av kurven (rød), vil da være lik reaksjonshastigheten som måles i Δ Abs/min. Konsentrasjonen av reaktanter og produkter endrer seg som sagt som en funskjon av tid, og måligene skjer under dynamiske forhold.


_{Figur 1: ∆Abs / min = stigningstallet til tangenten til kurven mellom Aførst og Asist}

Figuren viser en hyperbolsk kurve som eksempel på en grafisk fremstilling av målinger gjort med kinetisk metode.
∆Abs / min = reaksjonsshastigheten til enzymet
A_først = første absorbansavlesning 
A_sist = siste absorbansavlesning

Eksempel på bruk av kinetisk metode i laboratoriet:

Kinetisk metode er en måte en kan utnytte til å måle reaksjonshastisgheten i enzymaktivitet der hastigheten er tilnærmet lik konstant, dvs. 0. ordens kinetikk. Reaksjonen holder seg her til 0. ordens kinetikk da konsentrasjonen av substrat er høy og det finnes mange tilgjengelige enzymer. Reaksjonen til da går i maks hastighet og holde seg konstant over en viss periode.

_{Figur 2: Eksempel på kinetiske faser ved reaksjon med tilsetting av enzym}

Figuren viser de ulike kinetiske fasene en analyse av kolesterol i serum på Pentra 400 gjennomgår fra tilsats av et reagens (enzym), til reaksjonen har nådd likevekt.


I en kinetisk metode blir endring i et gitt tidsintervall målt gjennom redusert mengden enzym som kreves i tidsintervallet. Hastighetsgraden til en enzymkatalysert reaksjon med høy substratkonsentrasjon følger 0. ordens kinetikk. Når substratkonsentrasjonen avtar går reaksjonen inn i en fase av 1. ordens kinetikk. Ved påbegynt reaksjon, vil substratkonsentrasjonen, ved et gitt tidspunkt i hver reaksjon med 1. ordens kinetikk, følge følgende likning (1):

 (1)

Endringen i substratkonsentrasjon, Δ[S], over et gitt tidsintervall t1 og t2 følger denne likningen (2):

(2)

Ved start er endring i substratkonsentrasjon direkte proporsjonal med substratkonsentrasjonen. Detter gjelder generelt reaksjoner med 1. ordens kinetikk. For en enzymreaksjon gjelder 1. ordens kinetikk når [S] er liten sammenlignet med Km. Likningen over reduseres da til følgende likning (3):

eller (3)

Dette forteller oss at 1.ordens hastighetsgradkonstant, k, tilsvarer Vmax/ Km 

Metoder der substratkonsentrasjonens egenskaper (for eksempel lysabsorbans) måles ved to forskjellige tidspunkter under reaksjonsforløpet, kalles to-punkts kinetisk metode. Dette er teoretisk sett den mest nøyaktige metoden for bestemmelse av substrat gjennom bruk av enzymer.

Det enzymatiske reaksjonsforløpet vist ved reaksjonslikning (4):
(4)

Reaksjonslikningen viser at enzymet reagerer med substratet, og danner et ensymsubstratkompleks (ES-komplekset), deretter dannes det et produkt, og enzymet forblir uforandret. 


Ved kinetisk målemetode må man ha en konstant målehastighet ved målingen. Dette oppnås ved å holde reaksjonen i 0.ordens kinetikk. Her er substrat konsentrasjonen lavere enn ved 1.ordenskinetikk, dvs < 0,2 * Km. Enzymer med høye Km-verdier foretrekkes derfor ved bruk av kinetiske analysemetoder, da det gir mulighet for bruk av et større spekter av substratkonsentrasjoner. Når derimot 0. ordens kinetikk er nådd, vil reaksjonen være stabil og likevekt vil være oppnådd. Da er maksimumshastigheten nådd og hele enzymet befinner seg i et ES-kompleks(4). Introduksjon av kompetitive inhibitorer har blitt foreslått som en måte å øke Km for enzymer. Den lave substratkonsentrasjonen som er nødvendig for kinetiske analyser krever også måling av svært små endringer i for eksempel absorbans.

Referanse

1. Tietz, Fundamentals of clinical chemistry (2001), fifth edition, Saunders, Pennsylvania. side 145-154
2. Tietz, Fundamentals of Analytical Chemistry (2004), Eighth Edition, Thomson Learning Inc. kapittel 29, side 878 + 885-889 
3. Enzymkatalysert Konsentrasjonsmåling