HPLC – High-Performance Liquid Chromatography.
HPLC er en teknikk innen biokjemi/analytisk kjemi som separerer, identifiserer og måler mengden av forskjellige komponenter i en væske.
Analysen består av en mobilfase og en stasjonærfase som er sammensatt av partikler med liten diameter. HPLC er en type væskekromatografi, hvor væsken i kolonnen er den mobile fasen, mens selve kolonnen er den stasjonære fasen. Spesielt for HPLC er at der er omvendt fase. Den Stasjonære fasen som er kolonnen er upolar, mens den mobilde fasen som er væsken er polar.
Analysen blir gjort ved å injisere prøven inn i maskinen ved hjelp av en sprøyte. Her blir den blandet sammen med mobilfasen før den videre injiseres inn i kolonnen. Ved hjelp av høyt trykk fra en pumpe går prøven gjennom kolonnen, og det er her selve separasjoen skjer. Stoffene blir separert på grunn av molekyelens forskjellige polaritet og/eller størrelse. Separasjonen er og avhengig av løseligheten til mobilfasen, affiniteten til stasjonærfasen, temperaturen og intermolekylære krefter mellom prøvekomponentene.
I stasjonærfasen vil det være mulig å separere komponenter fra hverandre, siden kolonnen er fylt med partikler som avgjør hvor fort komponentene skal gå. Separasjonen skjer etter hvilken type kolonne man har, man kan bruke for eksempel pakket kolonne eller kapillærkolonne med ulike lengder og diameter. Separasjonen kan også forbedres ved å endre sammensetningen av mobilfasen.
Etterhvert som prøvekomponentene kommer ut av stasjonærefasen, leses det av på en detektor. Den tiden de ulike komponentene bruker fra de injiseres til de leses av detektoren kalles for retensjonstiden. Ved hjelp av retensjonstiden, såkan det bestemmes hvilke komponeter som er i prøven, ved å sammenligne de med retensjonstiden til referansekompnenter. Har de lik retensjonstid, så er det samme stoff. Retensjonstiden brukes også til å regne ut mengden av komponenter som er i prøven. For å gjøre det trengs også topphøyde på kurven eller arealet til kurven fra kromatogrammet.
Detektoren leser av retensjonstiden og et kromatogram vil bli printet ut.
Figur 1:Skjematisk tegning av HPLC /I.Kanfer/Figure2.gif)
Figur 2: Eksempel på kromatogram
Figur 3: Eksempel på ulike separasjoner ved ulik sammensetning av mobilfasen (vann, tetrahydrofuran og metanol)
Som vist i figur 2 vil man på x-aksen finne retensjonstiden, mens y-aksen viser signalet, ofte oppgitt i mAU.
Retensjonstiden brukes for å identifisere stoffene under gitte betingelser, mens toppens høyde (signal) eller areal kan sammen med en kalibreringskurve brukes til å beregne konsentrasjonen av aktuell analytt. Man kan bruke ulike deteksjonsprinsipp, blant annet UV/VIS-lys, fluorescens, brytningsindeks med mer.
Referanser
Figurer:
1,3. Forelesning i faget medisinsk laboratorieteknologi 2 “Kromatigrafi del 2 av 4” av Randi Utne Holt
2. J. Pharm Pharmaceut Sci, http://www.ualberta.ca/~csps/JPPS7(3)/I.Kanfer/ginkgo.htm, hentet 06.11.2014
Litteratur:
1. Burtis C.A, Ashwood E.R og Bruns D.E, TIETZ Fundamentals of Clinical Chemistry 6
2. Bach, R. Forelesning i Medisinsk Laboratoreteknologi 2, Kromatografi - GC, HPLC 11.11.15