Characterization of Janthinobacterium strains isolated from the skin and rearing water of Atlantic salmon (Salmo salar) fry

Slimhinner dekker skinnet, gjellene og tarmen til fisk. Den virker som en barriere mellom kroppen og omgivelsene. Plommesekkyngel er bakteriefrie når de klekker, men umiddelbart etter klekking blir slimhinnene kolonisert av mikroorganismer fra omgivelsene. Denne umiddelbare koloniseringen er viktig i å forme fiskens helse og utvikling. Utover dette er lite kjent om effektene på fisken som kommer av vert-mikrobe interaksjoner. Atlanterhavslaksen har en lang plommesekkyngel fase, noe som gjør det godt egnet til å studere interaksjoner mellom vert og mikroorganismer. Nylig har gruppen Analyser og kontroll av mikrobielle system (AKMS) utviklet et gnotobiotisk eksperimentell modell system, hvor lakseyngel kan holdes bakteriefrie gjennom hele plommesekk stadiet.

Målet med dette prosjektet var å studere den første koloniseringen av plommesekkyngel for fem Janthinobacterium sp. Stammer kalt PBA, PBB, 3.108, 3.109, og 3.116. Opprinnelig ble PBA og PBB isolert fra vann fra fiskeflasker med plommesekkyngel, mens 3.108, 3.109, og 3.116 ble isolert fra skinnet til lakseyngel fra et kommersielt resirkulerende akvakultur system (RAS). Vekst karakteristikker på det generelle dyrkingsmediet TSA/TSB og den enzymatiske profilen til de fem stammene ble studert før dere evne til å kolonisere plommesekkyngel ble undersøkt.

16s rRNA genesekvensene til de fem stammene var svært like. Derimot var både morfologien og de enzymatiske profilene deres forskjellige mellom stammene. Veksten til stammene på TSA/TSB med 0.1% Tween-80 viste at PBA og PBB har lilla kolonier, noe som indikerer violacein produksjon, mens 3.108, 3.109 og 3.116 har hvite fenotyper. Stammene vokste planktonisk i TSB med 0.1% Tween-80 med kraftig risting ved romtemperatur. Videre viste testen av 19 ulike enzymatiske aktiviteter en signifikant forskjell mellom den enzymatiske profilen til stammene.

Den første koloniseringen av plommesekkyngel for de fem Janthinobacterium sp. stammene ble undersøkt både for individuelle stammer, og en blanding av alle fem. På grunn av kontaminering og døde disk måtte eksperimentene for å studere koloniseringen av plommesekkyngel repeteres. Derfor ble totalt fire fiskeforsøk gjennomført. I det to siste, suksessfulle fiskeeksperimentene, ble de fem stammenes evne til å kolonisere yngel undersøkt ved å eksponere egg og plommesekkyngel for en blanding av de fem stammene (Exp. 3), og ved å eksponere (egg og (Om du eksponerte både egg og yngel)) yngelen for individuelle stammer (Exp. 4)

Evnen til å kolonisere og mulige interaksjoner mellom stammene i eksperiment 3 ble undersøkt ved hjelp av Illumina sekvensering av jqsA (koder for autoinducer syntethasen JQSA) amplikonsekvensering. På grunn av svært like 16s rRNA sekvenser valgte vi å bruke et annet gen (jqsA) for å skille mellom stammene.

Resultatene fra Illumina sekvenseringen viste at alle stammene, unntatt 3.116, kunne kolonisere lakseyngelen. Stamme 3.109, som tidligere har blitt isolert fra lakseyngelskinn, viste seg å være mest tallrik på plommesekkyngelen, mens PBA og PBB, isolert fra vann fra fiskeflasker, var mest tallrike i vann. CFU analysene av prøvene fra forsøkene med enkelt stammer stemte godt over ens med resultatene fra eksperimentene med ben blanding av alle stammene.

Mucosal surfaces cover the skin, gills, and gut of fish. It serves as a barrier between the body and the environment. Fish larvae are hatched germ-free, but immediately after hatching, the mucosal surface of the larvae is colonized by microbes from the surrounding environment. This initial colonization is known to be important in shaping fish health and development. However, little is known about host-microbe interactions and its effects on the fish. The Atlantic salmon has a long yolk sac fry period which makes it a preferable choice to study the interaction between host and microorganism. Recently, the Analysis and Control of Microbial Systems (ACMS) group developed a novel gnotobiotic experimental model system, where salmon fry can stay germ-free for its entire yolk sac fry stage.

The aim of this study was to investigate the initial colonization of Atlantic salmon yolk sac fry by five Janthinobacterium sp. strains called PBA, PBB, 3.108, 3.109, and 3.116. Originally, PBA and PBB were isolated from a rearing flask with yolk sac fry, while 3.108, 3.109, and 3.116 were isolated from the skin of salmon fry grown in a commercial Recirculating Aquaculture Systems (RAS). The growth nature on TSA/TSB general growth media and the enzymatic profiles of the strains was characterized prior to investigating their ability to colonize salmon yolk sac fry.

The 16S rRNA gene sequences were highly similar for the five isolates. However, morphology and enzyme assay profiles were different between them. The growth of the isolates on TSA/TSB with 0.1% Tween-80 revealed that PBA and PBB have purple colonies indicating violacein production, whereas 3.108, 3.109, and 3.116 have white phenotypes. The strains grew planktonic in TSB with 0.1% Tween-80 shaken vigorously at room temperature. Furthermore, the enzymatic activity test conducted to test the 19 enzymes in the strains showed a significant difference in their enzymatic profile among some strains.

The initial colonization of Atlantic salmon yolk sac fry by the individual strains, as well as a mixture of all five Janthinobacterium strains, was investigated. The experiments for studying the colonization of the yolk sac fry had to be repeated because contamination and fish death occurred in the first experiments. Hence, a total of four fish experiments were carried out. In two the final, successful fish experiments, the colonization of the fry by the Janthinobacterium sp. isolates was studied by exposing eggs and yolk sac fry to a mixture of the five strains (Exp. 3), and by exposing the eggs to each of the strains separately (Exp. 4).

The colonizing ability, as well as possible interaction between the strains in Experiment 3, was investigated by Illumina sequencings of jqsA ( encoding the autoinducer synthetase JQSA) amplicons. As the strains had highly similar 16S rRNA sequences, we chose to use another marker gene (jqsA) which could better differentiate between the strains.

The Illumina sequencing results showed that all of the strains except 3.116 were able to colonize the salmon fry. The 3.109 strain, originally isolated from salmon skin, appeared to have the highest relative abundance in yolk sac fry, while PBA and PBB, originally isolated from the rearing water of flasks with yolk sac fry, had the highest relative abundance in the water. The CFU analyses of the samples taken from the mono-associations corroborated well with the results from mixed experiments.