Effektiv separasjon innen kromatografi og elektroforese omhandler riktig innstilling av variablene for de ulike analysene, slik at det gir et mest mulig riktig resultat på kort tid.
Innen elektroforese er pH til bufferen, temperatur, vandretid og spenningen aktuelle variabler som påvirkerer separasjonen. Innstillingene av variablene vil påvirke i hvor stor grad ulike aminosyrer og proteiner vandrer gjennom systemet. Ved feilinnstilling av for eksempel pH kan prøven være for lite ionisert til å kunne skilles.
Innenfor de ulike formene for kromatografi er valg av mobil- og stasjonær fase viktig. For eksempel kan en stasjonær fase i tynnsjiktskromatografi der porene er av feil størrelse ikke inhibere elueringen nok, eller inhibere den slik at en fraksjon ikke slipper ut av kolonnen.
I tillegg har ionebytte-, væske-, adsorbsjon- og tynnsjiktskromatografi ulike variable som styrer graden av separasjon. Målet med effektiv separasjon oppnås ved å finne riktig mobil- og stasjonær fase samt innstillinger av temperatur/trykk/pH, og ikke minst tid for den enkelte prøve, som gir godt separerte og avlesbare topper.
Effektiv separasjon oppnås ved god oppløsning, som er et mål på avstanden mellom to topper (Rs > 0,8), god selektivitet, som er klart avgrensede topper (α) og effektivitet, det vil si graden av interaksjon mellom prøve og kolonnemateriale (N). I tillegg er tiden (t) viktig for at separasjonen skal være effektiv. Med høy selektivitet og effektivitet kan mindre tid gå med på å få en tilfredsstillende kurve. Eksempel på ulike kurver er vist i figur 1, med forklaringer under.
figur 1: Ulik grad av separasjon
Bildet viser:
A: Dårlig oppløsning (Rs), ok selektivitet (a), dårlig effektivitet (N).
B: God oppløsning (Rs) og selektivitet (a), dårlig effektivitet (N) og båndspredning (pga for lang analysetid (t)).
C: Svært god oppløsning (Rs), selektivitet (a) og effektivitet (N). For lang analysetid (t).
D: God oppløsning (Rs), selektivitet (a) og effektivitet (N). Tilfredstillende analysetid (t).
Kilder:
Fundamentals of clinical chemistry, Tietz, 6. Ed. Saunders Elsevier, kapittel 6; s.112-117
Forelesningsnotat: Kromatografi intro, Randi Anne Utne Holt