Fluorimetri er kvantitativ* analyse av fluorescens, emittert fluoriserende lys, fra atomer/molekyler.
Fluoriserende atomer/molekyler kalles fluoroforer.
Egenskaper hos molekyler som fluoriserer:
- Dobbeltbindinger (ikke alle)
- Stabile og plane ringstrukturer
Fluorescens
Absorpsjon av synlig/UV-lys med en bølgelengde (λ) hvis energi (E) eksakt tilsvarer
energidifferansen mellom S0 og S1 som medfører eksitasjon av et elektron fra grunnivå S0
til første eksitasjonsnivå S1 (se figur 1). Det eksiterte elektronet er ustabilt og taper noe av
sin energi i form av vibrasjon og rotasjon (VR). Elektronets tilbakefall til grunnnivå
S0 medfører deretter frigivelse av fotonenergi i form av synlig/UV-lys.
Denne fotonenergien er definert som fluroescence.
Figur 1: Kvantemekanikk bak fluorescens
Eksitasjonsbølgelengden (λex) er høyere i energi (E) enn emisjonsbølgelengden (λem)
som følge av tapt energi i form av vibrasjon og rotasjonsenergi. Dette medfører også at λex < λem.
Stokes Shift
Differanse mellom eksitasjonsenergi og emisjonsenergi som representerer energien som
tapes som vibrasjon og rotasjon (VR).
ΔE = Eex-Eem
Beskrivelse: Formel for stokes shift
Spektrofluorimeter
Et spektrofluorimeter er et instrument som benyttes til kvanitativ analyse av fluorescence. Spektrofluorimeterets grunnleggende komponenter er illustrert i figur 2.Eksitasjonsmonokromatoren siler ut et bestemt bølgelengdeområde fra eksitasjonskilden som sendes inn mot kuvetta hvor eksitasjonslyset absorberes av en bestemt fluorofor. Høyintensitets eksitasjonslys er kritisk for sensitivitet da fluorescence øker med økt intensitet på det innfallende lyset. Det brukes derfor ofte xenon lampe eller laser som eksitasjonskilde i spektrofluorimetere. Emisjonsmonokromatoren siler deretter ut en del av emisjonslyset (fluorescence) som sendes ut fra kuvetta i alle retninger. Signalet forsterkes og detekteres av en detektor, ofte en fotomultiplikator, hvor singalet genererer en elektrisk strøm som er proporsjonal til målt emisjonsintensitet.
Figur 2: Komponenter i et spektrofluorimeter
Det geometriske oppsettet eliminerer bakgrunsstøy som strølys.
Konsentrasjonsbestemmelse i fluorimetri
Fluorescence er direkte proporsjonal med konsentrasjon av fluorofor. Følgende sammenheng er
derviert fra Lambert-Beers lov og er gyldig for fortynnede løsninger hvor A < 0,05.
F = KΦP(0)abc
F : fluoresence intensitet i %
Φ: fluorescence effektivitet. Forhold mellom emitert lys og absorbert lys. Kvanteutbytte
P(0): eksitasjonsintensitet
a: molar absorbitivitet
b: volumenhet inne i kuvetta definert av det geometriske oppsettet mellom eksitasjonsspalte
og emisjonsspalte.
c: konsentrasjon i mol/L
K: stigning/sensitivitet
Φ , P(0), a og b holdes konstante
Φ Kvanteutbytte
Antall fluorescence emisjoner pr. foton som absorberes av fluoroforen.
Kvanteutbyttet er en stoffkonstant. Altså, karakteristiske for ulike fluoroforer.
Antall emitterte fotoner
Antall absorberte fotoner
Eksempel:
Et kvanteutbytte på 100% (Φ=1) betyr at hvert eneste absorberte foton medfører i et emittert foton.
Et kvanteutbytte på 0% (Φ=0) betyr at ingen absorberte foton har medført i et emittert foton. Stoffer som har Φ = 0 er altså ikke fluoriserende.
Det eksiterte elektronet kan henfalle (deaktiveringsprosesser) til grunnstilstanden gjennom rekke mekanismer. Henfall ved tap av eksitasjonsenergi i forbindelse med vibrasjon/rotasjon og fluroescence er eksempel på to slike mekanismer. Det finnes også andre mekanismer som resulterer fra noe som kalles (intersystem crossing, som blant annet kan medføre i phosforescence). Det viktigste er at disse mekanismene har det til felles at de er karakteristert med hver sin hastighetskonstant K. De inntreffer med ulike hastigheter. Kvanteutbyttet sier noe om prosentandelen av de eksiterte fluoroforene som deaktivieres gjennom fluroescence prosessen i forhohld til andre deaktiverende prosesser.
Φ = Kf/(Kf + Ki + Kx)
Kf: fluorescence
Ki: ikke-strålende henfall
Kx: intersystem crossing
Bølgelengdeskan
I en fluorescence analyse er man interressert i å vite noe om hvilken eksitasjonsbølgelengde
som gir høyest relativ fluorescence hos fluoroforen.
Eksitasjonsspekter
Eksitasjonsmonokromatoren sender eksitasjonslys av alle bølgelengder inn på kuvetta samtidig som emisjonsmonokromatoren står helt åpen. Eksitasjonsspekteret viser da sammenhengen mellom eksitasjonsbølgelengde og intensitet på emisjonslyset som vist i figur 3.
Toppen med høyest intensitet representerer den eksitasjonsbølgelengden som gir høyest relativ fluorescence.
Emisjonsspekter
Eksitasjonsmonokromatoren stilles inn på den eksitasjonsbølgelengden som gir høyest relativ fluorescence samtidig som emisjonsmonokromatoren siler ut den bølgelengden med høyest intensitet (se figur 3).
Figur 3: Forenklet eksitajsons og emisjonsspektrum. Eksitasjonsspekteret til venstre og emisjonsspekteret til høyre.
Prinsipp for instrumentell avlesning
Når egnet eksitasjonsbølgelengde og emisjonsbølgelengde er bestemt,
stilles de respektive monokromatorene inn på disse bølgelengdene.
Intensiteten på emisjonslyset vil da være proporsjonal med konsentrasjonen av fluorofor.
Begrensninger i fluorimetri
I forbindelse med fluorimetri er det en rekke begrensninger knyttet til konsentrasjonseffekter
(indre filter effekt og quenching), Matrix effekter (uspesifikk fluorescence, lysspredning) og temperatureffekter.
Indre filter effekt
Det lineære foholdet mellom konsentrasjon og fluorescence intensitet er gyldig når prøveløsningene absorberer mindre enn 2% av eksitasjonslyset. Altså når A < 0,05.Ved fortynnede løsninger som absorberer < 2% av eksitasjonslyset, er fluorescencen uniformt fotrdelt over eksitasjonslysets strålegang gjennom kuvetta (se figur 4). Høye konsentrasjoner av fluorofor medfører økt absorpsjon av eksitasjonslyset tildlig i strålegangen som medfører redusert intensitet i strålegangen over kuvetta (se figur). Noe som fører til at fluorescencen ikke fordeles uniformt over strålegangen. Da det typiske måleområdet er i midten av kuvetta, vil detektoren ved høyere konsentrasjoner av fluorofor oppfatte en lavere intensitet enn den sanne intensiteten som da er lokalisert i starten av strålegangen.
Figur 4: Til venstre: Indre filtereffekt ved høy konsentrasjon. P0 er eksitasjonslys inn mot kuvetta. Grønn farge representerer fluorescens.
Til Høyre: sammenhengen mellom %F og konsentrasjon ved økte konsentrasjoner.
Indre filtereffekt kan minimaliseres ved å bruke fortynnede løsninger eller rette måleområdet mot ytterkanten av kuvetta som vist i figur 5.
Figur 5: Til venstre: Minimalisering av indre filter effekt ved å skifte måleområdet mot ytterkanten av kuvetta.
Til høyre: typisk måleområde.
Quenching «slukking»
Ved høye konsentrasjoner vil eksiterte molekyler interaktere signifikant med hverandre og slik medføre at energi tapes gjennom andre mekanismer enn fluorescence. Quenching kan og være et resultat av tilstedeværelse av stoff som hindrer fluorescence. Et eksempel er Cl-.
Raman og Rayleigh lysspredning
Rayleigh
Fluoroforer som har små ΔE har overlappende eksitasjons og emisjonsspektrum som medfører at signaldeteksjonen er veldig følsom overfor strølys. Lysspredningen som inntreffer innebærer ingen endring i bølgelengde. Bruk av godt definerte emisjons og eksitasjons interferensfiltre kan minimalisere denne lysspredningen.
Raman
Lyssprendingen er uavhengig av eksitasjonsbølgelengden og er et resultat av løsemiddelets egenskaper. Lysspredningen inntreffer med en forlenget bølgelengde i forhold til eksitasjonsbølgelengden.
Temperatur
Φ for mange fluoroforer er sensitiv overfor temperaturendringer. Temperaturen bør derfor være regulert innenfor ± 0,1 °C ved fluorimetriske analyser. Den relative intensiteten på fluorescencen vil også reduseres med økende temperaturer med ca. 1-5 % per celsius grad.
Matrix
Serum/urin inneholder mange komponenter som er fluoriserende. Spesielt proteiner og bilirubin.
Referanser
1. Burtis CA. m.fl. TIETZ, Fundamentals of clinical chemistry. 6.utg.USA: Saunders Elsevier; 2008
s. 72-79.
2. Tutorial on Fluorescence and Fluorescent Instrumentation. Sitert den 15.11.2013. Tilgjengelig
fra: http://fmrc.pulmcc.washington.edu/DOCUMENTS/FMRC299.pdf
3. Mueller Joachim. Quantum Yield and Polarization. Sitert den 15.11.2013.
Tilgjengelig fra:http://www.physics.umn.edu/research/workshops/fluorescence/Fluoro4.pdf
4. Drogset, Siri. Fluorescence. Publisert 19.08.2013 på Itslearning.